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　　赤霉病（FHB）是世界范围内的毁灭性小麦疾病。而与小麦FHB抗性相关的是Fhb1上的成孔毒素（PFT）基因。在这项研究中，使用从小麦赤霉病菌感染的苏麦3号小麦穗中提取的RNA构建了高质量酵母双杂交文库。PFT的凝集素结构域对酵母细胞没有自激活和毒性，因此被用作诱饵来筛选Y2H文库。通过筛库获得了与PFT相互作用的23种蛋白质，这些蛋白质主要参与泛素化过程，网格蛋白涂层组装，氧化还原过程和蛋白质磷酸化。这些相互作用基因的表达模式通过实时定量PCR进行了验证。这项研究阐明了PFT的蛋白质相互作用，并提出了有关小麦FHB抗性的PFT调控网络。

　　诱饵自激活的检测：将载体pGBKT7，pCL1和pGBKT7-PFTa转化到Y190酵母菌株中，然后将所得转化体接种在带色氨酸且含有酵母半乳糖苷酶发色底物（SD/-Leu）的SD培养基上。阳性对照pCL1菌落在SD/-Leu/X-α-Gal平板上变为蓝色（图2B），但与阴性对照一样，pGBKT7-PFTa菌落也未变为蓝色（图2A，C），表明诱饵pGBKT7-PFTa在没有猎物蛋白的情况下不能自主激活报告基因，因此它适合用来构建酵母文库。

　　酵母文库的构建：提取小麦穗的总RNA，并质检总RNA是否完整、有无降解（图3A）。为了获得用于后续文库构建的高质量cDNA，使用SMART技术（Clontech）合成了cDNA，并在1％琼脂糖凝胶上通过电泳进行质检分析（图3B），使用Chroma Spin-1000色谱柱纯化消除小cDNA片段（图3C），然后转移至pGADT7载体以构建酵母双杂文库。为了确定cDNA文库插入片段的长度，随机选择了16个阳性克隆，并通过PCR扩增鉴定。结果表明插入的片段大小在0.5到2.25 kb之间（图3D），Y2H库可用于进一步研究。

　　PFT相互作用蛋白的筛选：将含有AD文库和pGBKT7-PFTa的Y190酵母细胞涂布到缺陷型平板上进行第一次筛选，总共生长了212个克隆，分离并测序所有质粒的插入片段，鉴定出57个不同的基因。由于存在假阳性克隆，我们将质粒pGBKT7-PFTa和代表不同基因的57个质粒分别转化到Y2HGold酵母细胞中。Y2HGold菌株由于自身无法合成His和Ade，所以无法在缺少两种必需氨基酸的培养基上生长。当诱饵和猎物蛋白相互作用时，GAL4响应并诱导His3和Ade2基因进行表达，使细胞能够生物合成这两个氨基酸，并在–His–Ade基本培养基上生长。最后，通过筛选鉴定了代表不同基因的23个阳性克隆（图4），并使用NCBI数据库和UniProt数据库对克隆测序结果进行比对分析，这样可获得具体对应的蛋白类型。